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产品介绍 在科研中,将外源性DNA引入单细胞绿藻(莱茵衣藻),会受到生物体刚性细胞壁的阻碍,导致转化失败或者效率很低。使用玻璃珠搅拌、电穿孔和微粒轰击等各种方法可以用于转化莱茵衣藻,但是转化效率非常低。Plus Trans 转化试剂有助于在电转化操作中将 DNA 递送到细胞中,可以有效提高转化效率。 • 对于细胞壁 (+) 藻株获得 >1000 转化体/μg DNA 实验步骤(以使用BioRad® Gene Pulser® II转化莱茵衣藻为例) 1. 复活1瓶冷冻莱茵衣藻细胞并接种到200 mL的TAP培养基中。在标准条件下培养细胞并保持监测其浓度3天。 2. 当细胞浓度达到1×106-2×106个细胞/mL时,2500 rpm离心5分钟收获细胞。弃去上清液,尽可能小心地除去所有液体。 注意: 细胞必须处于早期对数阶段并温和收获。如果细胞浓度为 <1×106个细胞/mL,您仍然可以收获细胞而不会显着影响转化效率。 3. 将细胞沉淀重悬于10mL Plus-Trans转化试剂中,并以2500 rpm离心5分钟。弃去上清液,并尽可能小心地除去所有液体。 4. 将沉淀再次重悬于10mL Plus-Trans转化试剂转化试剂中,并以2500 rpm再次离心5分钟。 5. 将细胞重悬于Plus-Trans转化试剂中,至终浓度为 2×108–3×108个细胞/mL。 6. 每250μL细胞悬液加入2-4 μg线性化 DNA,并在4°C下孵育5分钟. 7. 在BioRad® Gene Pulser® II上设置电穿孔参数如下:
8.在电穿孔前将250μL细胞DNA混合物转移到冰冷的比色皿中(预先冰上放置)。 9. 使用适当的设置对细胞进行电穿孔。通常,电脉冲持续时间约为30毫秒。 10. 电穿孔后,让细胞在冰上放置15分钟。 11.在室温下将细胞转移到含有10ml TAP-40mM蔗糖溶液的50mL锥形管或烧瓶中。 12. 将细胞放入藻室中并孵育14-16小时。 13. 2500rpm离心5分钟,收集细胞,弃去上清液,并将沉淀重悬于200μL TAP培养基中。 14. 将细胞铺在选择性TAP琼脂平板上,并在藻室中孵育5-7天。 注意: 菌落产量取决于质粒DNA的大小,选择标记和其他因素。 |