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产品描述 GeneticElectra DH10B T1噬菌体抗性感受态细胞具备极高的转化效率,转化效率可超过3 x 1010cfu /μg质粒DNA。它们是需要高效转化的应用的理想选择,包括cDNA和gDNA文库构建。GeneticElectra DH10B-T1细胞有效地提高有限克隆产物的转化率,允许有效克隆甲基化DNA,对T1和T5噬菌体有抗性,在含有X-Gal或Bluo-Gal的平板上通过α-互补支持蓝/白筛选,提供用于下游应用的高产量质粒对照。
基因型 F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139Δ(ara, leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG tonA 产品说明 DH10B-T1电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。DH10B-T1菌株来源于MC1061菌株,mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZ∆M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选,rpsL赋予其链霉素抗性。 DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建,经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。 操作方法 1. 2.5px 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的DH10B电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19; B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬,DNA浓度不超过100ng/μl,体积不超过5μl/50μl 感受态。 3. 用200 μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。 4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。 5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50ml离心管(BD Falcon50ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml。37℃,225 rpm复苏60分钟。 6. 5000rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径375px培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
注意事项 1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。 2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。 3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。 5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。 6. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。 7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通200ul枪头应剪去枪头尖15px) 避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。 |