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DNA和RNA定量方法的选择

DNA和RNA定量方法的选择

新一代测序(NGS)实验中,我们需要将精确量的DNA文库分子上样到测序仪中。如果测序运行时的文库分子过多或过少,都会使数据质量受损。这不仅浪费宝贵的样本和试剂,也浪费我们和仪器的时间。对于芯片分析(Microarray)和实时定量PCR(qPCR)而言,精确测定样本中的DNA或RNA也是必需的。

以往我们大多采用分光光度计来测定260 nm处的吸光度,对DNA和RNA进行定量。尽管这种方法被广泛采用,但并不意味着它的读数是准确而可靠的。紫外吸光度测量不具有选择性,无法区分DNA、RNA或蛋白质。而一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。此外,紫外分光光度计的灵敏度不足,无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。

Qubit 荧光定量仪采用荧光染料与特异的靶分子结合,只有当荧光染料与样本中的特异分子(DNA或RNA或蛋白质)结合时,才会发出荧光信号,从而大大提升了研究的准确性。并不是要推qubit 荧光定量仪,而是Qubit 的精准、灵敏等性能满足了新一代测序(NGS)实验。也就是说qubit 的诞生是必然的,qubit 荧光定量仪的与时俱进让它在新一代测序(NGS)实验中成为佼佼者,qubit 时代已经到来!

DNA或RNA的选择性PK

研究人员曾经做过实验,使用DNA和RNA含量相同的样本,利用qubit dsDNA BR 分析试剂盒测定其中DNA的浓度,结果发现测量结果在实际含量的的±2%范围内,足以证明qubit的厉害。之后,他们使用了RNA含量比DNA高10倍的样本,发现测得的DNA浓度仅比实际值高7%。再来看看分光光度计的表现吧。研究人员发现它们无法准确测定上述样本中DNA和RNA的含量(图下图)。好吧,第一回合qubit获胜。

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上图中,用qubit dsDNA BR和qubit RNA BR分析试剂盒及qubit荧光计,按照试剂盒实验方案检测含有lamBDa DNA (10 ng/μL)和不同量的大肠杆菌核糖体RNA (0-100 ng/μL)的样本,每个样品重复3次。然后采用NanoDrop ND-1000分光光度计检测同一样本三次,采用Perkinelmer LamBDa 35分光光度计检测一次。标示的浓度是在qubit®分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA和RNA的实际含量。

低浓度下的准确性PK

研究人员之后采用qubit® dsDNA HS分析试剂盒及qubit® 荧光计,定量浓度仅为10 pg/μL的样本中的DNA,发现测得值在实际值的±12%范围内。而采用分光光度计测量上述相同样本,测得的浓度比实际值高46倍。而对于10 ng/μL的样本,qubit® 测得值在实际值的±1%范围内,而分光光度计测定的浓度在实际值的±5%范围内(如图)。显然,在样本浓度低的情况下,使用qubit® 更为合适。

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上图中,qubit® 荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案,在qubit® 荧光计中采用qubit® dsDNA HS分析试剂盒重复10次测量浓度在0.01至10 ng/μL之间的lamBDa DNA。同时采用NanoDrop® ND-1000分光光度计重复10次测量相同浓度的DNA,比较结果的准确度(A) 和精度(B)。

样本浓度范围PK

qubit 的配套试剂盒有很多种,分别适合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白质。其中,双链DNA分析试剂盒又分为高灵敏度(HS)和宽范围(BR)两种,适合10pg/μL至1μg/μL的DNA。与之类似,qubit RNA HS和BR分析试剂盒覆盖的样本浓度范围在250 pg/μL至1 μg/μL。而分光光度计的检测范围通常在2 ng/μL至15 μg/μL(如图)。由此可见,qubit 适合的浓度范围更宽,不过,高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。 

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上图中. qubit®分析与采用NanoDrop®分光光度计进行紫外吸光度检测的样本浓度范围比较

其他方面PK

当然,分光光度计也有它的优势。全光谱吸光度读数可以通过吸收峰显示是否有污染物存在。另外,它的使用成本较低,上样、测定、擦拭即可,几乎不需要消耗品。而qubit® 则需要购买配套的分析试剂盒。

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